Биохимический практикум

Целью практики является освоение студентами практических навыков, необходимых для выполнения работ по классической биохимии, препаративной энзимологии, кинетических исследований ферментов.

К практике допускаются студенты, прошедшие курс «Методы исследования биологических макромолекул», в ходе которого были освоены базовые принципы лабораторной биохимической работы.

Основные задачи практики:

1. Научиться общим принципам работы в биохимической лаборатории, в том числе аккуратности, продуманности действий, соблюдения техники безопасности;
2. Получить навыки в выделении активных ферментов из живой ткани с использованием методов гомогенизации, дифференциального центрифугирования, осаждения сульфатом аммония, тепловой обработки, диализа, ионообменной и аффинной хроматографии;
3. Освоить метод электрофореза в ПААГ по Лэммли для определения молекулярной массы выделенных белков, чистоты полученного препарата, анализа стадий выделения фермента;
4. Научиться работать с выделенными либо коммерческими препаратами активных ферментов, определять их концентрацию и активность спектрофотометрическими методами, использовать ферменты в качестве аналитических реагентов;
5. Освоить принципы кинетических исследований ферментов: научиться определять удельную активность фермента, константу Михаэлиса, максимальную скорость.

План работы

В ходе данной практической работы студенты под руководством преподавателя производят выделение ферментов фруктозодифосфатальдолазы, пируваткинази и лактатдегидрогеназы из мышц кролика, после чего изучают некоторые их свойства.

На время проведения практики студенты разделяются на мини-группы по два-три человека, каждая мини-группа выделяет и изучает один из вышеперечисленных ферментов. На каждом этапе кроме чисто практической работы проводятся семинары для обсуждения текущей и предстоящей работы и контроля успеваемости.

Вначале студенты  готовят необходимые реактивы и материалы для выделения фермента и определения его активности, после чего они с использованием ранее выделенного либо коммерческого препарата фермента осваивают метод измерения его активности.

Затем производят выделение фермента из мышц кролика – мышцы измельчают, гомогенизируют, проводят экстракцию, центрифугирование, тепловую обработку. После этого следует несколько стадий дифференциального осаждения белков сульфатом аммония с сопутствующими центрифугированиями. Затем очищают белковую смесь от сульфата аммония с помощью диализа и проводят ионообменную/аффинную хроматографию со ступенчатой элюцией с последующей кристаллизацией фракции, содержащей целевой фермент. На каждой стадии выделения контролируют присутствие выделяемого фермента с помощью определения активности.

После этого проводят электрофорез в ПААГ по методу Лэммли. С помощью этого метода определяют чистоту и молекулярную массу полученного препарата, а также анализируют стадии выделения фермента.

Затем с помощью спектрофотометрических методов определяют концентрацию белка и удельную активность целевого фермента в полученном препарате.

После этого с помощью выделенного фермента определяют точную концентрацию субстрата в растворе энзиматическим методом. В этом методе фермент используется в качестве аналитического реагента, а определение точной концентрации субстрата требуется для расчета константы Михаэлиса на следующем этапе.

На заключительном этапе практической части работы проводят кинетические исследования выделенного фермента - определяют константу Михаэлиса и максимальную скорость ферментативной реакции. Для этого проводят ряд измерений скоростей ферментативной реакции при различных концентрациях субстрата, после чего рассчитывают константу Михаэлиса и максимальную скорость при помощи линеаризаций.

После окончания практической части работы студенты пишут подробные отчёты по проделанной работе и представляют её в виде докладов с презентациями на заключительном семинаре.

Программа производственной практики_Биохимический практикум.pdf

245.18 KB Скачать Просмотр

версия для печати